色譜是一種分離分析手段，分離是核心，因此擔負著分離工作的色譜柱是色譜系統(tǒng)的心臟。目前市場上色譜柱種類和規(guī)格繁多，在制藥、食品、環(huán)保、石化、農(nóng)林、醫(yī)療衛(wèi)生等領域有應用廣泛，相關從業(yè)人數(shù)不斷增長。

此次，我們一起來探討一下月旭色譜柱技術的特點及目前色譜柱技術總體發(fā)展中存在的壁壘。

 核殼結構色譜填料+體積排阻色譜填料

作為中國的色譜柱品牌，月旭科技自2005年從事色譜相關業(yè)務至今已走過了14個年頭。期間，月旭科技在色譜領域始終堅持自主研發(fā)和自主品牌，先后推出了包括Ultimate®、Xtimate®、Welchrom®、Topsil®和Boltimate®等多個品牌的色譜柱及色譜填料產(chǎn)品，并為客戶提供色譜分離分析技術、產(chǎn)品和整體解決方案。由于堅持創(chuàng)新，月旭科技在色譜填料的研發(fā)和色譜分離分析方法開發(fā)方面已經(jīng)達到國內(nèi)外領xian水平。據(jù)介紹，目前月旭團隊開發(fā)的色譜填料超過百余種，在醫(yī)藥、食品和環(huán)境檢測方面的應用超過5000個。其中有19款月旭色譜柱被列入美國USP-PQRI數(shù)據(jù)庫，2015版中國藥典中，有多個藥品品種*使用月旭色譜柱產(chǎn)品。依托技術優(yōu)勢，2018年月旭色譜柱年銷量取得了超過4萬根的好成績。以下是兩種月旭自主研發(fā)的國內(nèi)外領xian的色譜填料，一種是核殼結構色譜填料，另一種則是體積排阻色譜填料。

核殼結構色譜填料

該類填料初是由色譜科學家 Jack Kirkland 在2006年研制成功的一種新型色譜填料。它是將多孔硅殼熔融到實心的硅核表面而制備的。這些多孔的“光環(huán)”狀顆粒具有極窄的粒徑分布和擴散路徑，可以同時減小軸向和縱向擴散，允許使用更短的色譜柱和較高的流速以達到快速、高分辨率分離。

月旭科技研發(fā)的Boltimate®核殼色譜柱中硅膠顆粒粒徑是2.7μm，它是由1.7μm直徑的實心核與0.5μm厚的多孔層所構成的。這種核殼型的硅膠顆粒提供了較短的傳質(zhì)路徑，減少了軸向擴散，而實心核硅膠提供堅固的支撐結構，可以承受高壓，具有與1.8 μm 填料相似的分離效率，且柱反壓只有sub-2μm色譜柱的50%和明顯的抗污染性能。由于實心核的存在，以及薄的多孔層，使得樣品分子的擴散距離減小，即可以使用更高的流動相流速，極大的提高了分析速度。目前月旭已經(jīng)有Boltimate® C18、Boltimate® LP -C18、Boltimate® EXT C18、Boltimate® Phenyl-Hexyl、Boltimate® EXT PFP等多款該系列色譜柱。國外也有一些色譜柱廠家成功研發(fā)了該類型產(chǎn)品，例如AMT公司的HALO色譜柱、Sigma-Aldrich公司的Ascentis Express 核殼柱等。

核殼色譜柱填料結構

體積排阻色譜填料

體積排阻色譜(Size exclusion chromatography，SEC)是一種*按照溶質(zhì)分子在流動相溶劑中的分子尺寸大小分離的色譜法，是非常重要的分離分析生物大分子如蛋白質(zhì)、多肽、生物酶的工具。其分離原理如下：該類填料具有一定孔徑分布，當具有不同尺寸的目標物分子進入體積排阻色譜柱時，分子量很大的分子無法進入填料內(nèi)部孔中，因此zui先被洗脫下來；分子量相對較小的分子能夠進入一部分填料內(nèi)部孔中，因此隨后被洗脫下來；分子量很小的分子則能夠進入到填料的所有內(nèi)部微孔中，因而其洗脫體積接近色譜柱的柱體積；根據(jù)洗脫體積的不同，可實現(xiàn)各組分之間的有效分離。體積排阻色譜填料通常是具有適合一定孔徑的球形硅膠基質(zhì)填料，由于它具有良好的機械強度及具有*的分離純化效率，在生物大分子的分離分析領域廣泛使用。

月旭研發(fā)的Xtimate® SEC填料是在超高純?nèi)嗫坠枘z表面包覆一層具有良好穩(wěn)定性的親水性聚合物的體積排阻色譜填料，該填料的作用基團為二醇基。這種填料表面因受二醇基官能團保護而不與蛋白質(zhì)相互作用。使得蛋白、生物酶、多肽等樣品的非特異性吸附極小，因而廣泛應用于生物大分子的分離。目前月旭已有120A、200A、 300A、500A、700A、1000A和2000A等幾種孔徑尺寸規(guī)格的SEC色譜柱產(chǎn)品。國內(nèi)外也有一些色譜柱廠家成功研發(fā)了該類型產(chǎn)品，例如TOSOH公司的TSK gel SW-型色譜填料、安捷倫公司的ZORBAX GF色譜填料等。

月旭科技色譜柱

No.2 色譜技術發(fā)展迅速，填料技術仍存壁壘

液相色譜（HPLC）是一項、新穎、快速的分析分離技術，是廣泛應用的分析手段之一。隨著科技的進步，色譜得到了很大的發(fā)展，色譜技術性的研究在目前科研技術研究中一直占有重要定位，特別是一些相關檢測行業(yè)，應用性研究顯得十分普遍。而色譜柱填料是各種HPLC分離模式賴以建立和發(fā)展的基礎，因此高性能填料成為色譜研究中豐富、有活力、富于創(chuàng)造性的部分，且各種專用色譜填料的出現(xiàn)，解決了很多分析檢測中的問題。不過由于色譜技術基礎性、原理性的研究發(fā)現(xiàn)還有局限，目前仍然有很多問題解決不了的。

強極性物質(zhì)的保留

在強極性物質(zhì)保留方面，HILIC模式的提出雖然使大家看到了一線希望，不過該模式的原理研究不夠透徹全面，使得在應用的過程中，理論不能很好指導實踐，這就增加了方法摸索的難度。HILIC模式的優(yōu)勢在于多種色譜作用模式能分離開更多的物質(zhì)，且與反相和正相法有更多的正交性，但由于混合模式的多樣，使得次級吸附作用力的影響不能*避免，導致強極性物質(zhì)在HILIC模式下的峰形問題較大，同時色譜填料中與物質(zhì)的作用位點較多，使得填料的鍵合均勻度等引起的重現(xiàn)性問題顯得尤為明顯。

其次，反相條件下使用純水流動相也具有壁壘。現(xiàn)在“極性改性”技術的引進，使得非極性鍵合相的極性會有所增強，在極性環(huán)境（甚至是純水環(huán)境）下都會有很好的填料活性，而不會產(chǎn)生相塌陷，因此一些強極性物質(zhì)可以在此條件下有所保留。但是，純水流動相對于鍵合相的洗脫能力不夠，導致色譜柱易吸附同極性的物質(zhì)而被污染，改性填料導致結果不重現(xiàn)，同時也易引起填料污染導致的柱壓升高、峰形異常等現(xiàn)象而縮短色譜柱的壽命。

后，其他無機鍵合相對于強極性物質(zhì)保留的壁壘主要是基礎研究少、應用范圍窄、價格昂貴、色譜柱維護使用不常見且對人員操作要求高。

離子化物質(zhì)的分析分離

在分析分離離子化物質(zhì)時，也有很多的局限性。比如反相填料+離子對試劑是現(xiàn)在普遍采用的色譜分析方式，但該方式基線平衡時間長，使用后色譜柱沖洗時間長，填料容易受殘留離子對試劑的影響而改性。如果用這樣的色譜柱進行方法開發(fā)，后期新色譜柱不能重現(xiàn)結果的風險會大大增加，而且離子對試劑價格較貴，會增加分析成本。

離子交換法雖然專屬性強，是做單一物質(zhì)含量分離的良好選擇，但對于多組分分離，單一的色譜作用模式很難滿足多種性質(zhì)物質(zhì)的保留和分離，導致適用面較窄，而流動相通常使用高濃度的緩沖鹽，在儀器系統(tǒng)中易析出，不利于儀器的壽命，需要加強對儀器的沖洗維護。此外，鍵合相的官能團通常為小基團試劑，在高水、高鹽、低pH條件、高溫等條件下易水解，導致色譜柱壽命普遍短于反相大基團鍵合的填料。而HILIC法在分析離子化物質(zhì)時同樣有與在強極性物質(zhì)的保留方面相似的壁壘。

異構體的分離

分離光學異構體，特別是具有2個及2個以上的手性中心的異構體時，難度會大大增加。目前市場上這一類物質(zhì)的分離主要用到各種手性鍵合相或者手性流動相添加劑，其中手性鍵合相是主流。但是鍵合相大都采用涂覆工藝，有嚴格的耐受溶劑和柱壓要求，否則會加快涂覆官能團的脫落，縮短壽命。由于對手性分離不夠全面，在選擇固定相和流動相時，理論指導不夠，更多是要依靠實踐，所以增加了分析成本，降低了成功率。此外，由于手性色譜法專屬性強，常規(guī)要求拆分的物質(zhì)的化學純度在95%以上，這樣會導致該方法在檢測制劑時由于輔料等的干擾而不能對成品進行質(zhì)控。

對于位置異構體，由于物質(zhì)的極性、離子性等差異不大，目前較多的是選擇鹵代柱（PFP,F-C8）、高載碳量的C18（23%）柱、長碳量的反相（C22，C30）柱等利用其空間位阻效應將其分離。但是如果位置異構的基團較小，別的基團的空間位置效應較強，屏蔽了該小基團位置差異帶來的空間差異，也將無法分離。此外，單雙鍵異構對于現(xiàn)在的色譜技術同樣有很大的挑戰(zhàn)，目前暫時沒有有效手段能將其分離。